O que é HPLC e como Funciona? -

O que é HPLC e como Funciona?

Colunas de HPLC

Autor convidado: Dr. Ramkumar Dhandapani

O nome Cromatografia vem da palavra grega Croma que significa Cor, e da palavra Graphein que significa escrever. O primeiro uso registrado da Cromatografia em Coluna remete ao Cientista russo Mikhail Tsvet, que esmagou o Carbonato de Cálcio em um tubo e adicionou folhas de plantas verdes homogeneizadas, seguidas por Solvente Orgânico. Ele viu bandas coloridas separadas à medida que o Solvente passava pelo tubo. É assim que a Cromatografia começou, no início, separando com sucesso vários pigmentos das folhas.

Atualmente, há muitos analitos incolores e separados por técnicas Cromatográficas, como a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC), que ainda recebem o mesmo nome.

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

É uma forma de Cromatografia em Coluna que bombeia uma mistura de Amostra ou Analito em um Sistema de Solvente comumente conhecido como Fase Móvel no fluxo especificado através de uma Coluna que contém a Fase Estacionária. A separação do Analito acontece com base na interação do Analito com a Fase Móvel e a Fase Estacionária.

Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC)

Essa Tecnologia é baseada no princípio de que partículas menores levam a uma maior Eficiência, separações mais rápidas com Resolução e Sensibilidade Superiores. No entanto, para tolerar a pressão extrema de partículas menores que 2 μm, o Sistema precisa ser capaz de lidar com Alta pressão de trabalho. A Eficiência que essas Colunas produzem não deve ser perdida em nenhum outro lugar no volume morto do instrumento.

Os Equipamentos de UHPLC foram projetados para lidar com isso. Como os Equipamentos de UHPLC têm um custo elevado, sempre há o desejo de usar o Equipamento de HPLC existente e alcançar um Desempenho equivalente ao do UHPLC. No final da década de 2000, a Phenomenex lançou Colunas de 2,6 μm com a Tecnologia Kinetex Core-Shell, que fornecem esse Desempenho de UHPLC em um HPLC tradicional.

Modos de Separação

Existem muitos modos Cromatográficos de separação e cada um tem suas próprias particularidades. Abaixo é apresentada uma árvore de Seleção de Coluna de HPLC para orientar os leitores a escolherem o modo correto de Análise. Embora haja muitos modos de Separação disponíveis para resolver misturas Cromatograficamente, a separação de Fase Reversa (reversed phase, RP) é bastante popular e o modo mais comum em Cromatografia Líquida.

"Por que a Fase Reversa é chamada de Fase Reversa?”

A resposta é simples. A Cromatografia evoluiu a partir do uso da Fase Estacionária Polar e da Fase Móvel não Polar como o principal componente de Fase Móvel e isso foi considerado como prática normal. Por isso, o nome Fase Normal. Embora esse modo separasse os Analitos com base na natureza Polar, haviam muitas misturas de Analitos que não eram Polares e tinham características Hidrofóbicas que precisavam de Separação. O uso da Fase Estacionária Não Polar e da Fase Móvel Polar ajudou a separar esses Analitos Hidrofóbicos. Uma vez que essa prática é inversa à Fase Normal, o termo Fase Reversa é usado. Isso é o mesmo que chamar um jogador de pingue-pongue destro de jogador normal e um jogador de pingue-pongue canhoto de jogador reverso.

Processo de Separação de Fase Reversa

Agora que sabemos que o modo mais popular de Cromatografia Líquida é o reverso, vamos examinar como ele funciona. Abaixo pode ser vista uma representação esquemática genérica do processo de separação. A mistura de Analitos representados por pontos azuis, roxos e vermelhos é introduzida como uma banda na Coluna, que contém uma Fase Estacionária de Fase Reversa não Polar. As setas vermelhas representam a direção do fluxo da Fase Móvel. À medida que a banda de Analitos mistos é aplicada a Coluna, a Fase Móvel empurra os Analitos para dentro da Coluna. Conforme eles avançam pela Coluna, eles entram em contato com a Fase Estacionária. Os Analitos com maior afinidade com a Fase Estacionária (pontos azuis) serão retidos mais fortemente e eluídos mais tarde na corrida. Assim, você pode separar os Analitos com base na intensidade com que eles interagem com a Fase Estacionária.

Nesse próximo exemplo, a Fase Estacionária consiste em uma Fase Hidrofóbica, Apolar e, mais frequentemente, uma C18. A Fase Móvel consiste em um componente Polar, Hidrofílico e Aquoso, geralmente Água e Acetonitrila ou Metanol. Os Analitos serão separados com base em sua afinidade relativa para essas duas Fases. Compostos Hidrofóbicos, como Benzopirenos, terão forte afinidade com a Fase Estacionária Hidrofóbica e estarão fortemente ligados. Compostos Hidrofílicos, como o Sulfato de Etila, terão pouca afinidade com a Fase Estacionária e permanecerão principalmente na Fase Móvel e serão rapidamente transportados pela Coluna.

Embora a separação de Fase Reversa tenha contribuído com a interação Hidrofóbica, há três mecanismos primários de interação que ditam o comportamento Cromatográfico geral. Isso inclui:
1. Interações Hidrofóbicas
2. Interações Polares
3. Interações Iônicas

Além desses três, a Seletividade Estérica, ou Seletividade de Forma, pode, às vezes, ser usada. Usando o exemplo do Tapentadol como um composto farmacêutico típico de molécula pequena, vamos explorar os três principais mecanismos de interação. Essa molécula tem componentes Polares, Hidrofóbicos e Iônicos.

Interações Hidrofóbicas

Na RP-HPLC, o mecanismo primário que dita o comportamento de retenção é a interação Hidrofóbica entre a ligação da Fase Estacionária não Polar (por exemplo, C18) e a natureza Hidrofóbica da molécula da Amostra (por exemplo, a estrutura de Carbono). Essa é uma interação fraca e transitória entre a Fase Estacionária não Polar e as moléculas, que inclui interações Hidrofóbicas e de Van Der Waals. Uma estimativa justa da retenção pode ser prevista com base no valor do Log de P, que é o coeficiente de partição Octanol: Água numa Extração Líquida-Líquida. Em outras palavras, quanto mais Hidrofóbica for uma molécula, maior será o valor do Log de P que ela possui, o que se traduz em mais retenção na RP-HPLC.

Interações Polares

Essas são interações que ocorrem entre os grupos de função Polar dos Analitos e os Silanóis residuais, os grupos Polares incorporados ou de superfície, ou o capeamento Polar da Fase Estacionária. Eles interagem com o Analito por meio da ligação de Hidrogênio e interações
Dipolo-Dipolo. Essas interações são relativamente fracas e transitórias em comparação com a interação de troca Iônica.

Interações de Troca Iônica

A maioria dos recheios de fase reversa baseiam-se em Sílica ligada a uma Fase Estacionária não Polar, como uma C18. Embora fabricantes Cromatográficos como a Phenomenex tentem obter capeamentos finais completos de todos os grupos de Silanol, elas não podem ser 100% completas. O que resulta em grupos de Silanol de superfície residual (Si-OH) ocultos. Esses Silanóis podem se tornar desprotonados e adquirir uma carga negativa, e então podem interagir ionicamente com moléculas básicas com carga positiva. Essas interações de Troca Iônica são muito fortes e lentas em contraste com as interações Hidrofóbicas e Polares. Portanto, quando ocorre a troca iônica, os analitos experimentam diferentes taxas de interação (lenta versus rápida), isso pode levar à distorção de Pico. Esse é um exemplo clássico de Analitos básicos interagindo com Silanóis residuais, que podem ser controlados pela neutralização do Silanol ou neutralização do Analito ao executá-los em pH elevado.

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