Vacina de DNA
Plataformas Diagnósticas e Terapêuticas Baseadas em Ácidos Nucleicos são ferramentas promissoras que estão substituindo plataformas baseadas em proteínas, devido às suas propriedades únicas, como termoestabilidade, resistência à desnaturação e armazenamento simples. Uma boa Plataforma de Vacina deve ser rápida, simples de desenvolver, reprodutível, termoestável e fabricável com custos e riscos de desenvolvimento reduzidos. A Plataforma de DNA aborda muitos desses desafios.
Vacinas de DNA são Vetores de DNA, como plasmídeos bacterianos, DNA minicircular ou construções de expressão lineares covalentemente fechadas, que contêm pelo menos um Cassete de Expressão Eucariótico que codifica o antígeno de interesse. Um Cassete de Expressão consiste tipicamente em um promotor/potencializador eucariótico, um gene de antígeno e uma sequência de sinal poli(A), que são essenciais para a expressão do antígeno em células eucarióticas, como as células musculares. As Vacinas de DNA demonstraram segurança e imunogenicidade convincentes em estudos pré-clínicos. Diversas Vacinas de DNA estão atualmente aprovadas para uso veterinário em animais de grande porte (como cavalos) e de pequeno porte (como galinhas). Com base nos resultados de segurança, imunogenicidade e eficácia do ensaio clínico de Fase 3 do ZyCoV-D, a Índia concedeu-lhe autorização de uso emergencial, o que também representa um marco no desenvolvimento de Vacinas de DNA. Ensaios clínicos com Vacinas de DNA para o Vírus do Nilo Ocidental (Western Nile Virus – “WNV”), os Vírus Ebola e Marburg, e SARS-CoV-2 demonstraram que os anticorpos são produzidos em humanos semanas após a imunização. No entanto, também há muitos casos de baixa imunogenicidade em ensaios clínicos. Antígenos-alvo e a otimização dos métodos de construção, formulação e administração parecem ser fatores-chave na imunogenicidade das Vacinas de DNA.
Nos últimos anos, muitos avanços foram feitos no campo das Vacinas de DNA. Avanços na construção, nas vias de entrega e administração do DNA, e o uso de adjuvantes moleculares aumentaram a imunogenicidade das Vacinas de DNA. A Imunização por DNA promete revolucionar o campo das vacinas. As Vacinas de DNA são mais baratas de fabricar e armazenar, tornando-as candidatas ideais para Vacinações Globais, mesmo em países de baixa renda.
O DNA plasmidial é produzido por bactérias geneticamente modificadas, geralmente Escherichia coli (E. coli). A produção de DNA plasmidial seguindo as Boas Práticas de Fabricação (BPF) em escala pré-clínica e clínica requer o desenvolvimento cuidadoso de processos comerciais ideais e econômicos. As células bacterianas são cultivadas em condições fermentativas, geralmente em um meio de cultura celular definido ou mínimo, constituído por substâncias quimicamente definidas, como glicose ou glicerol como fonte de carbono, sais, vitaminas, etc. Após a fermentação, as células bacterianas são coletadas por centrifugação ou microfiltração. A lise celular é então realizada por métodos químicos, físicos ou mecânicos. A lise celular produz um lisado contendo restos celulares, DNA plasmidial e impurezas solúveis. Técnicas de Clarificação, como Filtração por Fluxo Tangencial (Tangential Flow Filtration – “TFF”), são utilizadas para remover sólidos dos lisados. Contaminantes (por exemplo, proteínas do hospedeiro, endotoxina, RNA, DNA genômico, formas lineares e circulares abertas de DNA plasmidial). O DNA plasmidial purificado é formulado com excipientes e adjuvantes e filtrado através de filtros estéreis.
O DNA do minicírculo foi gerado pela indução de recombinação intramolecular do plasmídeo parental em E. coli. Por exemplo, a expressão de recombinases, como a integrase φC31, e de Enzimas de Restrição (Restriction Enzymes – “REs”), como I-SceI, é induzida pelo sistema de expressão gênica induzível por arabinose. As recombinases mediam a recombinação sítio-específica entre suas sequências de reconhecimento, resultando em duas moléculas de DNA circulares distintas: (I) um DNA minicircular contendo um Cassete de Expressão Eucariótica e (II) um Miniplasmídeo (MP). O MP pode ser especificamente degradado pela RE induzida. O DNA do minicírculo pode então ser extraído, purificado e formulado de forma semelhante ao método utilizado para plasmídeos de DNA.