DNA Plasmidial
Plasmídeos são pequenas moléculas circulares de DNA fita dupla contendo informação genética extracromossômica, presentes em arqueas, bactérias e algumas leveduras. Eles contêm pelo menos uma origem de replicação e podem se replicar independentemente. Uma célula pode conter múltiplas cópias de um único plasmídeo. A informação genética da sequência principal do plasmídeo pode não ser necessária, mas pelo menos ajuda a célula a sobreviver em seu ambiente.
Nas últimas décadas, o DNA plasmidial (pDNA) tornou-se uma das ferramentas mais importantes em genética e biologia molecular e, mais recentemente, em terapia gênica e vacinas de ácido nucleico. Em aplicações farmacêuticas, o uso de plasmídeos inclui vias diretas e indiretas, como a administração direta de plasmídeos a pacientes, ou seja, o próprio paciente receberá o DNA. Para tais aplicações, incluindo vacinas de DNA, as Boas Práticas de Fabricação (BPF) são um requisito essencial, pois o próprio DNA é o ingrediente farmacêutico ativo (IFA). Outra forma é a indireta, ou seja, o pDNA não é utilizado diretamente para administração em pacientes, mas sim para produzir vetores virais ou proteínas terapêuticas para células transfectadas, ou como molde para produzir mRNA, ou seja, não é um API, mas sim produzido como matéria-prima ou material de partida. Mesmo neste caso, o produto plasmidial está sujeito a requisitos regulatórios específicos (em termos de controle de qualidade e documentação do processo) e à conformidade com as normas aplicáveis.
A preparação de plasmídeos em laboratórios de pesquisa científica frequentemente utiliza kits de extração disponíveis comercialmente, mas esse método não é adequado para a produção industrial que requer vários miligramas ou vários gramas. Além disso, os plasmídeos preparados por métodos laboratoriais apresentam baixa reprodutibilidade em termos de pureza e segurança, o que é um pré-requisito para aplicações farmacêuticas. Dado o amplo uso do pDNA no desenvolvimento de terapias avançadas atuais, ele se tornou um material essencial para aplicações biofarmacêuticas de próxima geração, e a demanda da indústria por pDNA de alta qualidade está aumentando. Portanto, sua produção deve atingir maior eficiência e produtividade.
Seleção de células hospedeiras
A seleção de células hospedeiras é um dos fatores decisivos em biotecnologia, e a produção de plasmídeos depende da cepa/plasmídeo, por isso é muito importante selecionar uma cepa adequada para um plasmídeo adequado. As características de uma cepa hospedeira adequada incluem a capacidade de ser transformada por plasmídeo e sua viabilidade de atingir alta biomassa. Devido à grande quantidade de informações biológicas disponíveis sobre Escherichia coli (E. coli) e seu uso na produção de pDNA, diversas cepas foram selecionadas para a produção de pDNA com base no uso em laboratório e na disponibilidade comercial.
Além disso, a introdução de pDNA em E. coli resulta em uma carga metabólica, geralmente refletida na diminuição da taxa de crescimento e da biomassa, e no aumento da produção de acetato. Compreender o mecanismo pelo qual a produção de plasmídeos é afetada em nível fisiológico geral não é um desafio pequeno, mas esse conhecimento pode fornecer informações úteis para futuras pesquisas em engenharia celular, como knockout ou superexpressão gênica, para aliviar a carga metabólica dos organismos hospedeiros. Ou compreender melhor o mecanismo do hospedeiro para a replicação do pDNA, aumentando assim a produção de pDNA. No entanto, a engenharia de células hospedeiras também pode levar a modificações excessivas, dificultando o controle e a previsão das atividades fisiológicas que ocorrem no hospedeiro. A capacidade de controlar as células hospedeiras é muito importante em operações de larga escala.
Para a produção de BPF, bancos de células mestre (BCM) e bancos de células de trabalho (BCT) precisam ser estabelecidos para garantir o cultivo reprodutível em larga escala de organismos bacterianos. Os bancos de células precisam ser totalmente caracterizados e atender aos padrões de qualidade aplicáveis, incluindo identidade do hospedeiro, consistência de qualidade e rendimento, pureza do banco de células e inspeção dos recipientes, além de serem armazenados adequadamente para produção subsequente.
Estratégia de Fermentação
Técnicas de fermentação bem estabelecidas para a produção de proteínas recombinantes são igualmente aplicáveis à produção de pDNA. No entanto, como diversos usos terapêuticos requerem grandes quantidades de plasmídeos, há a necessidade de aumentar a eficiência da produção de pDNA. Diversas abordagens têm sido propostas para melhorar a produtividade de pDNA, incluindo rendimentos volumétricos de pDNA e produtividade específica para células bacterianas.
Múltiplos parâmetros afetam a produtividade bacteriana, como a seleção do banco de células-mestre, a taxa de crescimento, o meio, a taxa de alimentação e as condições de crescimento adequadas, além de parâmetros operacionais como pH, osmolaridade e temperatura.
A fermentação de E. coli atualmente otimizada pode geralmente atingir 40 a 60 g/L de biomassa, e o rendimento de pDNA pode atingir 0,5 a 1 g/L. Combinando a engenharia de células hospedeiras e vetores, e otimizando ainda mais a estratégia de fermentação, pode atingir > 2 g/L.
O aumento de escala da fermentação requer a manutenção de condições de reação ótimas e homogêneas para minimizar a exposição de E. coli a condições de estresse e melhorar a precisão metabólica, aumentando assim o rendimento e garantindo a qualidade consistente do produto. Uma caracterização abrangente e detalhada do processo é necessária para identificar os parâmetros mais relevantes que afetam o rendimento e a qualidade do produto e mantê-los o mais constantes possível durante o escalonamento. A caracterização do processo pode ser realizada com dados coletados em tempo real ou quase real a partir do monitoramento em linha ou em linha, combinados com métodos e ferramentas de suporte, como análise e modelagem de dados quimiométricos e elucidação das condições de mistura e fluxo. Para garantir um escalonamento simples e bem-sucedido, as instalações de fermentação precisam ser projetadas estritamente de acordo com os padrões de escalonamento para reduzir a variabilidade das condições do processo em diferentes tanques, considerando plenamente a interdependência e a interação altamente complexas entre os parâmetros de fermentação.
Colheita e Lise Celular
A centrifugação é a forma mais comum de coletar caldo de E. coli. Em condições de escala laboratorial, ela pode realizar um processo simples e rápido. Para escala de produção, centrífugas de disco de grande porte ou centrífugas de fluxo contínuo podem ser utilizadas. O desafio é o alto investimento de capital, o alto consumo de energia e as etapas manuais que podem ser complexas e exigir operação aberta. A filtração por fluxo tangencial é outra estratégia facilmente escalável e permite uma operação fechada contínua, durante a qual o meio é trocado para o sistema tampão necessário para a etapa subsequente de lise.
Métodos de lise mecânica utilizados na produção de proteínas recombinantes podem ser utilizados para a extração de ácidos nucleicos. No entanto, as condições de alto cisalhamento utilizadas no processamento de proteínas podem levar à degradação dos ácidos nucleicos. Portanto, o método de lise celular mais comumente utilizado aqui é a lise alcalina, geralmente realizada com solução de NaOH 0,1-0,5 N, pH ~12, combinada com SDS 0,1-0,2% ou Triton X 1-00, para romper as células, aproveitando a fragilidade da membrana celular, e manter o pDNA intacto. O aumento de escala desse método pode ser desafiador, pois o aumento da viscosidade pode levar ao cisalhamento do pDNA durante a mistura. Além disso, gradientes de pH podem existir em condições de larga escala, garantindo uma mistura adequada, mas não muito vigorosa. O tempo do processo de lise também pode afetar diretamente a qualidade e a quantidade de pDNA. Se for muito longo, pode causar desnaturação irreversível do pDNA. Portanto, equipamentos de mistura bem projetados e parâmetros de lise cuidadosamente controlados são a chave para o sucesso.
Clarificação
Após a lise celular, os sólidos precisarão ser removidos. Devido à viscosidade do lisado, esta será uma etapa muito crítica. As impurezas podem ser removidas usando filtros centrífugos ou de profundidade com poros de tamanho específico. Mais recentemente, a floculação tem sido relatada como uma etapa de pré-tratamento em operações de filtração. Existem também estratégias para remover contaminantes por precipitação usando tampões com alto teor de sal e agentes caotrópicos. Normalmente, no lisado de células bacterianas após a clarificação, apenas cerca de 3% do conteúdo é pDNA, enquanto os 97% restantes são outras impurezas, incluindo 65% de proteína, 25% de RNA, 4% de endotoxina e 3% de DNA genômico. Essa complexidade também é um desafio do processo de pDNA a jusante. Outros desafios incluem seu próprio tamanho de partícula grande, alta viscosidade, sensibilidade ao cisalhamento e similaridade com impurezas.
Filtração de fluxo tangencial
A filtração de fluxo tangencial é uma tecnologia simples e econômica de concentração de pDNA e troca de tampão que pode ser facilmente ampliada. Ela pode remover parcialmente impurezas como DNA linear, RNA e endotoxinas por meio da seleção de um MWCO adequado, e reter o pDNA. Um desafio das operações de filtração por fluxo tangencial é o aumento da viscosidade da solução de alimentação durante essa etapa e a sensibilidade do pDNA ao cisalhamento. E, em alguns casos, devido às propriedades estruturais do pDNA ou ao menor tamanho efetivo de partícula devido à maior força iônica, o pDNA pode atravessar poros de membrana menores que seu tamanho de partícula e causar perdas. Portanto, considerando a regra prática de 3-5X para seleção de poros de membrana, a extremidade inferior dessa faixa pode ser escolhida para garantir o rendimento.
Cromatografia
O pDNA final deve atender aos requisitos regulatórios de qualidade, como ser livre de proteínas da célula hospedeira, DNA genômico, RNA e endotoxinas, e pode exigir mais de 90% de pDNA superenrolado para aplicações específicas. Portanto, as etapas de cromatografia são incluídas no fluxo do processo de pDNA como requisito básico para produzir pDNA eficiente e seguro. Dada a complexidade das impurezas e sua similaridade com o pDNA alvo, uma combinação de diferentes modos de estratégias cromatográficas pode ser utilizada.
A cromatografia de troca aniônica (AEX) utiliza interações eletrostáticas entre plasmídeos com carga negativa e fases estacionárias com carga positiva para separar seletivamente o pDNA superenrolado do pDNA circular aberto e outros componentes do lisado, mas biomoléculas com carga e estrutura semelhantes, como gDNA, endotoxina e alguns RNAs, serão copurificadas. Uma estratégia frequentemente utilizada em combinação com a AEX é a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), que aproveita a hidrofobicidade das impurezas de ácidos nucleicos de fita simples (RNA, gDNA desnaturado e pDNA) e endotoxinas para facilitar a ligação e impedir a passagem dessas impurezas por meio de suportes hidrofóbicos, que separam o pDNA das endotoxinas e dos ácidos nucleicos de fita simples, mas requerem altas concentrações de sal para a eluição. A cromatografia de afinidade (CA) pode obter pDNA superenrolado de alta pureza em uma única etapa de purificação e garantir que o produto esteja dentro dos padrões regulatórios. Utilizando processos biológicos naturais baseados em reconhecimento molecular, o pDNA superenrolado é purificado seletivamente. No entanto, os ligantes biológicos utilizados podem ser instáveis e geralmente apresentam baixa capacidade de ligação. Outro método que realiza um bom trabalho na remoção de RNA e proteínas é a cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), que aproveita a diferença no tamanho hidrodinâmico das partículas entre o pDNA e outras impurezas, mas apresenta um desafio na remoção do gDNA.
Filtração estéril
A filtração estéril é projetada para reter bactérias e garantir a esterilidade. O maior tamanho de partícula, a pureza após a purificação e a composição do tampão do pDNA podem afetar a vazão do filtro, resultando em menores vazões e rendimentos por etapa. Antes de selecionar um filtro com uma especificação adequada, esses fatores precisam ser considerados de forma abrangente para maximizar o desempenho de filtração do grau de esterilização.
Armazenamento
Produtos de pDNA destinados ao uso direto ou indireto em aplicações farmacêuticas requerem sistemas de armazenamento adequados que possam monitorar e relatar as condições de armazenamento para atender a todos os requisitos de BPF. Estudos de avaliação específicos são necessários para determinar as condições ideais de armazenamento. Para o pDNA armazenado em condições controladas a -20 °C, a análise mostra que a proporção de formas circulares abertas e superenroladas ou covalentemente fechadas permanece inalterada, não há linearização ou degradação do pDNA e a transfecção do DNA apresenta expressão inalterada, ou seja, as condições de armazenamento preservam efetivamente a integridade do DNA.
Requisitos gerais de qualidade
Agências reguladoras e/ou compradores de pDNA terão diferentes padrões e expectativas de qualidade, considerando os diferentes usos do pDNA, como matérias-primas/materiais de partida essenciais, intermediários, substratos para fármacos ou produtos farmacêuticos no desenvolvimento de fármacos. No entanto, a concentração de DNA, a carga biológica/esterilidade, a endotoxina (por exemplo, <0,1 UE/µg de plasmídeo ou <5 UE/kg de peso corporal), a pureza (proteína residual da célula hospedeira) (por exemplo, indetectável ou <0,01 µg/dose), o DNA genômico (testes de liberação, como <0,05 µg/µg de plasmídeo ou <0,01 µg/dose), o RNA (se indetectável) e a consistência são requisitos comuns.