Lentivírus
O Lentivírus (LV) é um subtipo de Retrovírus, com tamanho de partícula de 80-120 nm, constituído por uma sequência de RNA Fita Simples (Single Stripe RNA – “ssRNA”), que é transcrita em DNA e pode ser integrada ao genoma do hospedeiro, resultando em infecção persistente. A maioria dos Vetores Lentivirais é derivada do HIV-1 e mantém a capacidade de se integrar ao genoma das células infectadas. O Lentivírus é muito popular em aplicações clínicas devido à sua capacidade de transduzir com mais eficiência células não proliferantes ou de proliferação lenta. Recentemente, vários ensaios clínicos utilizaram Lentivírus Autoinativado de Terceira Geração para introduzir genes em Células-Tronco Hematopoiéticas para o Tratamento de Imunodeficiência Primária ou Hemoglobinopatias. A aplicação mais comum do Lentivírus é a administração de genes introduzidos via Receptores de Antígenos Quiméricos (Chineric Antigens Receptors – “CARs”) ou Receptores de Células T Clonadas para gerar imunidade contra tumores.
Para a Produção Upstream de Lentivírus, embora estudos tenham demonstrado que é viável preparar linhagens celulares estáveis de empacotamento/produção de Vetores Lentivirais, o que tem o potencial de melhorar a consistência entre lotes, garantir o fornecimento e reduzir custos, pois pode simplificar a operação e a cadeia de suprimentos da produção de Lentivírus, mas frequentemente requer um longo tempo para o desenvolvimento da linhagem celular, a Estratégia de Transfecção Transitória de DNA Plasmidial baseada em células HEK293T ainda é a principal escolha para a produção em larga escala de Vetores Lentivirais. Para a cultura celular, na fase de desenvolvimento, a cultura aderente é dominante, dada a necessidade de apenas pequenos volumes de lote, as propriedades aderentes das células HEK293T e a fácil disponibilidade de consumíveis. Mas, como o aumento de escala exigiu tamanhos de lote maiores e mais consistentes, a produção mudou para cultura em suspensão em Biorreatores de Tanque Agitado ou Oscilante, e a escolha de meios e suplementos estava diretamente relacionada aos métodos de produção. A expansão das células está relacionada à atividade e ao sucesso do Processo Downstream. Como o meio pode afetar a estabilidade do Vetor e formar a solução de alimentação que entra no fluxo, ele precisa ser cuidadosamente otimizado.
Comparado ao Adenovírus (AV) ou ao Vírus Adeno Associado (Adeno-Associated Virus – “AAV”), o maior desafio do processamento a jusante do Lentivírus é que ele é um Vírus Envelopado, e sua complexidade e sensibilidade inerentes exigem processamento rápido, como sua sensibilidade a ciclos de congelamento e descongelamento, sal, pH, cisalhamento e pressão osmótica do tampão, e as partículas têm menor estabilidade térmica, com meia-vida de 7 a 8 horas a 37 °C. O processo a jusante do Lentivírus também pode ser dividido em 3 Etapas Principais, incluindo Coleta e Clarificação; purificação intermediária, que inclui uma ou mais etapas de concentração e purificação; polimento, formulação e, opcionalmente, filtração estéril.
O Lentivírus é um produto extracelular liberado pelas células produtoras no fluido de cultura, portanto, a qualidade do fluido de coleta é altamente dependente da viabilidade celular, que determina o teor de impurezas derivadas da célula hospedeira. A Clarificação visa remover células e detritos celulares, e a Filtração em Profundidade é uma opção fácil e econômica para esta etapa. Após a otimização, pode atingir rendimentos próximos a 100%. Para melhorar a segurança biológica geral do Produto Final e cumprir as normas regulatórias, o tratamento com Nuclease é geralmente necessário para digerir os Ácidos Nucleicos, o que também é benéfico para reduzir a viscosidade do líquido de alimentação e facilitar as etapas subsequentes. Geralmente, é realizado após a Etapa de Clarificação, mas também há relatos de sua realização após uma redução adicional de volume em uma etapa posterior.
A Cromatografia é uma tecnologia fundamental no esquema de purificação, visando a remoção de proteínas, ácidos nucleicos, impurezas de baixo peso molecular e lipídios, etc. A Cromatografia de Troca Aniônica operada em Modo Liganate-Eluição e a Cromatografia Multimodo operada no Modo Fluxo Contínuo foram relatadas, utilizadas isoladamente ou em combinação para a purificação de LV. No entanto, como mencionado anteriormente, devido à sensibilidade do LV a condições como salinidade e pH, as condições do tampão cromatográfico devem ser cuidadosamente otimizadas. O uso de Cromatografia de Afinidade com Metal Imobilizado e Cromatografia de Exclusão por Tamanho também foi relatado, mas geralmente limitado a escalas menores. A Filtração de Fluxo Tangencial (Tangential Flow Filtration – “TFF”) é uma tecnologia rápida e robusta de concentração de fluido de alimentação e troca de tampão. Para LV, pode-se selecionar um Filtro de Fibra Oca de Corte de Peso Molecular (Molecular Weight Cut-Off – “MWCO”) de 750 kD. Um filtro de 0,22 μm pode ser usado para a filtração estéril do substrato do fármaco antes do enchimento, mas, considerando o grande tamanho de partícula da LV, relata-se que a perda dessa etapa pode chegar a 30-50%, e uma estratégia para reduzir a perda é realizá-la antes da etapa final da Filtração de Fluxo Tangencial ou usar um Sistema Fechado para obter um processamento totalmente asséptico e pular essa etapa.