Anticorpo Bispecífico
Anticorpos biespecíficos (bsAbs) podem se ligar simultaneamente a dois tipos diferentes de antígenos ou a dois epítopos diferentes no mesmo antígeno e podem ser projetados em uma variedade de formas estruturais, que podem ser divididas em duas categorias: semelhantes a IgG e não semelhantes a IgG. O primeiro retém a estrutura de dois braços Fab e uma região Fc do mAb tradicional, mas os dois sítios Fab se ligam a antígenos diferentes, que geralmente são produzidos pelo quadroma ou hibridoma híbrido. No entanto, esse método depende do acaso para formar bsAbs disponíveis, resultando em baixa eficiência. Outro método para produzir bsAbs semelhantes a IgG, chamado de “knobs into hole” (KiH), baseia-se na introdução de mutações de aminoácidos grandes na cadeia pesada de um mAb e mutações de aminoácidos pequenos em outra cadeia pesada. Isso permite uma melhor ligação da cadeia pesada de interesse (e sua cadeia leve correspondente) e permite uma produção mais confiável de bsAbs. Os bsAbs não semelhantes a IgG não possuem a região Fc, portanto, a estratégia de design é relativamente simples. Isso inclui Fabs quimicamente ligados, bem como vários tipos de fragmentos variáveis de cadeia única (ScFvs) bivalentes e trivalentes. Existem também algumas proteínas de fusão que imitam os domínios variáveis de dois anticorpos. Entre estes, novos formatos também incluem acopladores de células T biespecíficos (BiTEs), construções antiparalelas tetravalentes (TandAbs) e Bi-Nanocorpos somente VH. As características comuns de vários bsAbs não semelhantes a IgG são baixo peso molecular e, portanto, alta permeabilidade ao tecido tumoral, mas meia-vida relativamente curta.
Por meio de diferentes designs estruturais e mecanismos de ação, as vantagens terapêuticas dos bsAbs incluem: mediação de células imunes para matar células tumorais; direcionamento duplo de pontos de verificação imunes, exercendo funções únicas ou sobrepostas, prevenindo eficazmente a resistência a medicamentos; especificidade aprimorada e toxicidade off-target reduzida; Reduz efetivamente os custos do tratamento, pois estudos demonstraram que o efeito terapêutico do BiTE pode ser de 100 a 1.000 vezes maior que o dos anticorpos convencionais, e a dose pode ser tão baixa quanto 1/2.000 da dose original, reduzindo significativamente os custos do tratamento medicamentoso. Comparado à terapia combinada, o custo do bsAb também é muito menor do que o custo da combinação de dois medicamentos isolados.
E. coli é uma escolha comum para expressões de scFv porque a bactéria cresce rapidamente em meios baratos e pode produzir grandes quantidades de proteína. No entanto, as moléculas de scFv expressas podem ser mal dobradas ou formar corpos de inclusão, exigindo etapas adicionais do processo para solubilizar e redobrar a proteína. Esses problemas podem ser superados usando linhagens celulares de mamíferos, como a CHO, porque as células eucarióticas possuem processos avançados de dobramento de proteínas e a capacidade de sofrer modificações pós-traducionais complexas, o que permite expressar proteínas de forma estável em altos títulos e apresenta boa escalabilidade do processo. Por razões semelhantes, bsAbs do tipo IgG são expressos principalmente em linhagens celulares de mamíferos. Mas, para estruturas heterodímeras assimétricas, é necessária engenharia específica de proteínas/células, como as técnicas KiH e CrossMab relatadas, para facilitar o pareamento correto e mitigar os desafios impostos por impurezas, como cadeias pesadas livres, cadeias leves, homodímeros e anticorpos mal pareados, melhorando a manufaturabilidade do produto.
A composição dos meios de cultura celular demonstrou afetar a qualidade do produto, portanto, o design do meio deve ser considerado como um meio de controlar os níveis de agregados e variantes em culturas celulares. Ao mesmo tempo, o ajuste da temperatura da cultura celular também demonstrou controlar a formação de semianticorpos e agregados. Em termos de métodos de cultura, estudos demonstraram que, em comparação com a cultura tradicional em batelada alimentada, a cultura por perfusão pode melhorar a qualidade e a produtividade dos bsAbs, reduzindo o tempo de residência dos produtos no biorreator, prevenindo o acúmulo e o aumento da concentração e reduzindo a degradação física ou química das moléculas de bsAbs.
No processo subsequente, devido à certa similaridade estrutural entre mAb e bsAb, muitos métodos de purificação de bsAb são desenvolvidos com base no processo de purificação maduro de mAbs, como afinidade, carga, tamanho, hidrofobicidade e etapas de cromatografia em modo misto, mas também aplicam outras estratégias para superar os desafios específicos que os bsAbs representam, incluindo agregados, formação de fragmentos e produtos pareados incorretamente. A cromatografia de afinidade para proteína A ainda é um dos métodos de purificação por afinidade mais comumente usados em processos de bsAb downstream. Além disso, no projeto de bsAb, ao introduzir uma mutação pontual em uma cadeia pesada para alterar a afinidade de ligação da proteína A, os dímeros homólogos e heterólogos podem ser separados por meio de cromatografia de afinidade diferencial para proteína A. A cromatografia de afinidade para proteína A também se mostrou eficaz na separação de meio-anticorpos de produtos alvo por eluição em gradiente de pH. A mesma estratégia também foi explorada para a proteína G. Para bsAbs baseados em fragmentos, você pode escolher cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) ou ligantes de afinidade que podem se ligar à região CH1 ou às cadeias Kappa ou Lambda, como a cromatografia de afinidade para proteína L. A cromatografia de troca iônica é geralmente usada como uma etapa de purificação, combinada com condições operacionais específicas, também pode ser usada para remover produtos e fragmentos mal pareados. A cromatografia de modo misto, combinando e utilizando múltiplas técnicas fundamentais de separação, demonstra o potencial de aprimorar ainda mais as capacidades das plataformas de purificação a jusante, e diferentes tipos dessas resinas demonstraram remover produtos, fragmentos e agregados com pares incorretos. A filtração por fluxo tangencial é frequentemente utilizada para fins de concentração e troca de tampão no processo, mas alguns estudos também demonstraram que agregados de bsAb podem ser facilmente removidos selecionando um tamanho de poro específico, como 300 kD.