Análise de Compostos Básicos por HPLC: Como Melhorar o Formato do Pico
A Cromatografia Líquida em Fase Reversa é uma das abordagens mais utilizadas para a análise de compostos com diferentes características químicas. Entretanto, durante o Desenvolvimento de Método, alguns analitos podem apresentar comportamentos que dificultam a obtenção de uma separação adequada.
Um exemplo frequente ocorre na análise de Compostos Básicos, nessas situações, problemas como Picos com Cauda, Assimetria e perda de Reprodutibilidade podem não estar relacionados apenas à escolha da Fase Móvel ou às condições instrumentais. A própria interação entre o analito e a superfície da Fase Estacionária pode exercer um papel importante.
Por que Picos de Compostos Básicos Podem Apresentar Cauda?
Em uma coluna C18 convencional, o principal mecanismo de retenção é a interação hidrofóbica entre o analito e as cadeias alquil ligadas à superfície da sílica. Porém, a superfície da sílica também pode apresentar grupos silanois residuais.
Quando um Composto Básico se encontra carregado positivamente nas condições da análise, ele pode apresentar Interações Secundárias com esses grupos da superfície da sílica. Essas interações adicionais podem fazer com que diferentes moléculas do mesmo analito apresentem tempos de interação ligeiramente diferentes com a Fase Estacionária. O resultado pode ser observado no Cromatograma como um pico menos simétrico, frequentemente apresentando Cauda.
Por Que Isso é um Problema no Desenvolvimento de Método?
Um pico assimétrico pode dificultar a integração, reduzir a resolução entre compostos próximos e tornar o Desenvolvimento de Método mais trabalhoso. Uma estratégia comum para contornar esse comportamento é modificar a Fase Móvel, utilizando Tampões ou Reagentes de Pareamento Iônico. Porém, essas abordagens também podem aumentar a complexidade do método e diminuir a vida útil da coluna. Por isso, em alguns casos, vale olhar para outra variável: a Química da própria Fase Estacionária.
O que muda em uma PS C18?
A PS C18 continua sendo uma Fase Reversa baseada em C18, mas apresenta uma modificação adicional na superfície da sílica, a incorporação de um Grupo Funcional Polar com carga positiva.
Essa modificação altera a maneira como determinados analitos interagem com a Fase Estacionária. Para Compostos Básicos carregados positivamente, essa superfície pode promover uma leve repulsão eletrostática, reduzindo a interação indesejada desses compostos com grupos silanois expostos. Com isso, a contribuição das Interações Secundárias pode ser reduzida e o comportamento cromatográfico passa a ser mais favorável ao Formato do Pico Simétrico.
E Isso Realmente Faz diferença?
Para avaliar esse comportamento, um estudo comparou quatro Fases Estacionárias da família Kinetex:
C18;
XB-C18;
EVO C18;
PS C18.
Todas utilizavam a mesma tecnologia de Partículas Core-Shell e apresentavam características semelhantes de porosidade e área superficial. Dessa forma, a principal diferença entre elas estava justamente na química da Fase Estacionária.
O composto utilizado como modelo foi a Clorfeniramina, escolhida porque apresenta problemas conhecidos de Formato do Pico em condições típicas de Fase Reversa. As quatro colunas foram avaliadas sob as mesmas condições cromatográficas.
A utilização da PS C18 proporcionou uma melhoria de 62% no Fator de Cauda USP, em comparação com a C18 convencional na condição avaliada.
Então, A PS C18 é Apenas uma C18 para Compostos Básicos?
Não, a presença do grupo positivo também altera a seletividade da coluna. A PS C18 oferece uma combinação de Seletividade Polar e Hidrofóbica, mantendo o mecanismo típico de Fase Reversa, mas adicionando características que podem ser úteis para determinados analitos.
Essa combinação também pode favorecer a retenção de Compostos Ácidos, já que a carga positiva da superfície pode contribuir para interações adicionais com espécies carregadas negativamente
Quando Considerar uma PS C18?
A PS C18 pode ser uma alternativa interessante quando o método apresenta alguns sinais específicos, por exemplo:
Compostos Básicos com Cauda persistente;
Compostos Ácidos com baixa retenção em uma C18 convencional;
Analitos polares que exigem fases móveis 100% aquosas;
Necessidade de explorar uma Seletividade diferente mantendo uma química baseada em C18.
Quando Interações Secundárias estão prejudicando o seu método, mudar a Química da Fase Estacionária pode ser uma estratégia mais eficiente do que simplesmente continuar adicionando complexidade à Fase Móvel.
