Insulina
O diabetes é uma doença global que afeta mais de 420 milhões de pessoas (6% da população mundial), número que deverá aumentar para 500 milhões em 2030 e 700 milhões em 2045. O aumento no número de pacientes diabéticos em todo o mundo levará a um consequente aumento na necessidade de insulina. Além disso, existe uma necessidade não atendida de insulina acessível, especialmente em países de baixa e média renda. Muitas pessoas com diabetes tipo 1 que dependem exclusivamente de insulina não têm acesso a ela. Dos 60 milhões de pessoas com diabetes tipo 2 que necessitam de insulinoterapia, uma em cada duas não tem acesso à insulina devido ao preço (OMS 2021).
A insulina injetável é importante no tratamento tanto do diabetes tipo 1 quanto do tipo 2, e a insulina humana recombinante demonstrou oferecer vantagens significativas em relação à insulina extraída. Para a produção de insulina, dois métodos diferentes foram relatados. No primeiro método, as cadeias A e B da insulina são cultivadas separadamente em bactérias como corpos de inclusão. Em seguida, as duas cadeias são purificadas separadamente, unidas quimicamente e, por fim, purificadas novamente. Na segunda técnica, a pró-insulina é expressa em E. coli sob a forma de um promotor de triptofano com metionina ligada à pró-insulina. O Brometo de Cianogênio (CNBr) é utilizado para clivar a ligação, formando o peptídeo dobrado através das ligações dissulfeto corretas e, finalmente, eliminando enzimaticamente o peptídeo C. A “rota da pró-insulina” é preferida por exigir apenas um único procedimento de fermentação e purificação, e o processo de produção é mais eficiente em comparação com a abordagem combinatória de duas cadeias.
Além do uso de bactérias como sistema hospedeiro, leveduras também são utilizadas para a produção comercial de insulina. As principais cepas de levedura utilizadas comercialmente são Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. O sistema de expressão baseado em levedura produz um precursor de insulina solúvel que é secretado no sobrenadante da cultura. Existem vantagens e desvantagens no uso de bactérias e leveduras como sistemas de expressão. A produção de insulina precursora pela via dos corpos de inclusão bacterianos geralmente resulta em concentrações e produtividade mais elevadas do produto. Comparados à expressão solúvel de proteínas terapêuticas bioativas, os corpos de inclusão apresentam boa estabilidade mecânica e são resistentes à degradação proteolítica. Em termos de purificação subsequente, as proteínas-alvo nos corpos de inclusão também são isoladas em um estado mais puro e concentrado em comparação com as proteínas secretadas, que exigem a remoção de grandes quantidades de impurezas proteicas da célula hospedeira dos sobrenadantes de cultura. Os peptídeos também são mais fáceis de isolar dos corpos de inclusão devido aos seus tamanhos e densidades diferentes em comparação com as proteínas da célula hospedeira.
A utilização de Escherichia coli como sistema de expressão para a produção em larga escala de insulina recombinante apresenta vantagens como alta taxa de crescimento, requisitos de meio de cultura simples, facilidade de operação, alto rendimento e custo-benefício. A E. coli também é bem caracterizada geneticamente, e um grande número de linhagens hospedeiras mutantes e vetores de clonagem estão disponíveis. No entanto, a via de produção de corpos de inclusão em E. coli requer processamento complexo, como procedimentos de solubilização e renaturação, para a obtenção de polipeptídeos totalmente funcionais. Para a maioria das empresas biofarmacêuticas, a Escherichia coli permanece o sistema hospedeiro de escolha para a produção de insulina recombinante, com a insulina humana e seus análogos expressos em corpos de inclusão na maioria dos casos. Os análogos de insulina são variantes sintéticas da insulina cuja sequência de aminoácidos difere da insulina humana nativa. Essas alterações são realizadas para mimetizar mais de perto o padrão fisiológico normal de secreção de insulina em humanos.
A molécula precursora de insulina de cadeia única nos corpos de inclusão de E. coli apresenta, em sua maioria, dobramento incorreto. Os corpos de inclusão são extraídos das células, lavados e as moléculas precursoras são solubilizadas. A produção de pró-insulina requer o enovelamento do peptídeo e a formação concomitante de ligações dissulfeto. Após uma reação enzimática, a molécula precursora renaturada é convertida em uma molécula de insulina heterodimérica pela remoção da cadeia C e do peptídeo de fusão N-terminal. Diversas etapas de purificação cromatográfica são necessárias para remover proteínas da célula hospedeira, ácidos nucleicos, detritos de membrana e subprodutos da digestão, a fim de obter produtos altamente purificados.
O processo de purificação de insulina humana recombinante/análogos a partir de corpos de inclusão de E. coli é complexo, envolve múltiplas etapas e os detalhes dos processos estabelecidos por diferentes empresas são frequentemente confidenciais. O método utilizado em cada etapa terá um grande impacto na pureza e no rendimento do produto na etapa seguinte, portanto, uma análise e pesquisa aprofundadas devem ser realizadas durante o desenvolvimento e a otimização.