Células-Tronco Mesenquimais (Mesenchymal Stem Cells - “MSCs”)
Células-Tronco Mesenquimais (MSCs) isoladas de diversos tecidos representam uma área significativa de pesquisa clínica. Além de suas capacidades de proliferação e diferenciação, as MSCs podem modular respostas imunes, promover neovascularização, auxiliar a angiogênese e proteger células-alvo da apoptose por meio do contato direto célula a célula, da liberação de citocinas e da secreção de vesículas extracelulares (VEs). No entanto, apesar de um histórico relativamente longo de descobertas, a produção de MSCs e produtos à base de MSCs continua sendo um grande desafio. Para terapias celulares, milhões de células devem ser obtidas para atingir a eficácia clínica ideal, dependendo do modo e da frequência de infusão. Para produzir construções de engenharia de tecidos de tamanho clinicamente relevante, centenas de milhões de células são necessárias. Isso requer a expansão in vitro das MSCs. Portanto, a expansão eficiente e econômica das MSCs é crucial para sua aplicação em terapia celular e engenharia de tecidos.
Existem quatro grandes desafios associados à produção em massa de Células-Tronco Mesenquimais (MSCs). Em primeiro lugar, as MSCs são células dependentes de ancoragem, o que significa que não podem ser cultivadas em frascos de agitação tradicionais ou reatores de tanque agitado como as células em suspensão. O segundo desafio envolve a composição do meio de cultura celular. Embora os meios de cultura de células basais forneçam uma fonte de energia e contenham sais fisiológicos e tampões de pH, eles não possuem proteínas de adesão e fatores de sinalização biológica essenciais necessários para a sobrevivência, o crescimento e a diferenciação celular. Consequentemente, os meios de cultura basais são tipicamente suplementados com soro natural. No entanto, a introdução de proteínas estranhas do soro bovino fetal comumente utilizado pode levar a respostas imunes após a infusão celular. Além disso, as células cultivadas podem ser suscetíveis a infecções por vários vírus, micoplasmas e príons conhecidos e desconhecidos. O terceiro fator-chave é cultivar as células em concentrações fisiológicas de oxigênio. In vivo, as MSCs crescem e funcionam sob tensões de oxigênio mais baixas do que o ambiente de 21% de oxigênio fornecido pelas incubadoras tradicionais. Dependendo da taxa de consumo e da vascularização do tecido, a tensão de oxigênio varia de níveis muito baixos (menos de 1% de O2) na zona profunda da cartilagem articular a até 7,8% de O2 no tecido adiposo. Esses dados sugerem que a baixa tensão de oxigênio representa o que é conhecido como hipóxia fisiológica, com a função eficiente da cadeia respiratória ocorrendo dentro de uma faixa estreita específica de concentrações de oxigênio para diferentes tipos de células. Um quarto desafio é o potencial de expansão celular em ambientes 3D, que facilitam interações célula-célula dinâmicas por meio de vários tipos de contatos célula-célula e moléculas de sinalização bioativas, em contraste com culturas 2D não fisiológicas. A expansão de células em microambientes 3D pode melhorar a qualidade do produto celular final, incluindo propriedades como “stemness”, quimiotaxia, imunomodulação e angiogênese.
O método tradicional de expansão de MSCs é o cultivo estático em frascos de cultura celular; no entanto, essa abordagem apresenta um alto risco de contaminação devido ao manuseio manual frequente. Sistemas robóticos fechados podem oferecer uma solução viável para esse problema. Além disso, o cultivo de células em condições 2D requer múltiplas passagens, o que pode alterar o fenótipo e induzir a senescência. Além disso, uma grande área de superfície é essencial para atingir uma massa celular terapêutica, necessitando de um espaço físico significativo. Os sistemas de biorreatores apresentam excelente escalabilidade e atendem aos requisitos para a produção de MSCs terapêuticas. Além disso, os biorreatores são classificados como sistemas fechados, o que reduz significativamente o risco de contaminação. Com exceção dos projetos mais simples, a maioria dos biorreatores é equipada com sensores para monitorar parâmetros essenciais do processo. Diversas estruturas de biorreatores foram desenvolvidas e podem ser classificadas com base no tipo de potência de entrada. Reatores acionados mecanicamente, incluindo tanques agitados e biorreatores de onda, podem cultivar MSCs aderidas a transportadores em um meio de cultura continuamente misturado, atingindo uma densidade celular de 10^5 a 10^6 células/mL. Isso os torna adequados para a produção de células terapêuticas.
Biorreatores de tanque agitado estão entre os tipos de reatores mais amplamente utilizados devido à sua estrutura simples, escalabilidade e desempenho excepcional. Em sua forma mais simples, os reatores de tanque agitado consistem em um recipiente contendo um impulsor. Reatores menores de bancada e em escala piloto com volumes de trabalho limitados podem utilizar aeração de sobreposição, enquanto reatores de maior escala podem ser equipados com dois ou mais impulsores e sistemas de aeração adicionais. Aumentar a velocidade dos impulsores de agitação melhora a mistura e o suprimento de oxigênio; no entanto, também eleva as forças de cisalhamento. Como células dependentes de ancoragem, as MSCs podem ser cultivadas em microcarregadores, formar agregados celulares ou ser encapsuladas em hidrogéis ou microvesículas dentro desses sistemas. Quando cultivadas em microcarregadores, a interação entre as partículas de mistura e o fluxo do meio pode inibir a formação de agregados de múltiplos microcarregadores e facilitar a migração celular para microcarregadores desocupados. No entanto, altas velocidades de mistura não são ideais, pois as MSCs são sensíveis à tensão de cisalhamento, que pode afetar adversamente suas propriedades imunomoduladoras, induzir diferenciação ou causar danos celulares. Dada a relativa simplicidade dos biorreatores de tanque agitado, inúmeros estudos têm relatado sua aplicação na cultura de MSCs, tornando essa tecnologia cada vez mais adequada tanto para novas pesquisas quanto para aplicações industriais.
Em um biorreator de ondas, as células são alojadas em um saco plástico preso a uma plataforma aquecida e oscilante. O movimento oscilante da plataforma promove a transferência efetiva de massa e energia, minimizando a formação de espuma. Como resultado, o uso de agentes antiespumantes pode ser reduzido ou até mesmo eliminado da formulação do meio. Este biorreator é particularmente adequado para células sensíveis ao cisalhamento, pois a distribuição da tensão de cisalhamento dentro do sistema de cultura é mais uniforme. Nesse tipo de biorreator, as MSCs podem ser cultivadas na forma de agregados; no entanto, vários fatores devem ser considerados para otimizar a formação de agregados.
O cultivo de MSCs em biorreatores requer o uso de carreadores para facilitar a adesão celular. Tipicamente, microcarreadores são empregados para obter células fenotipicamente estáveis em escala terapêutica. Esses microcarreadores podem ser construídos a partir de uma gama diversificada de materiais e revestidos com vários substratos de adesão. Geralmente, os microcarreadores podem ser categorizados em dois tipos principais: microcarreadores lisos e microcarreadores macroporosos. No caso de microcarreadores lisos, as células crescem na superfície sem penetrar o núcleo. Por outro lado, em microcarreadores macroporosos, as células são encapsuladas dentro das partículas e crescem dentro delas. Consequentemente, os microcarreadores fornecem uma área de superfície maior do que os sistemas 2D dentro do mesmo volume de meio de crescimento. Foi relatado que as MSCs foram expandidas com sucesso 43 vezes em microcarreadores em um reator de tanque agitado de 50 litros, produzindo 1,28 × 10^10 células. Para evitar tensão de cisalhamento durante a cultura, alguns protocolos recomendam o carregamento de células em esferas de hidrogel usando dispositivos microfluídicos especializados. Alternativamente, as células podem ser cultivadas como agregados ou esferas automontados. Em geral, o uso de esferas imita mais fielmente as condições naturais do tecido. Além disso, a presença de moléculas de adesão, incluindo vitronectina, integrina e laminina recombinantes no meio de crescimento, é essencial para promover a automontagem de agregados celulares, o que torna a produção em larga escala de MSCs em esferoides relativamente custosa.
Ao expandir MSCs em microcarreadores, um desafio significativo a ser enfrentado é o processo de coleta. Tradicionalmente, enzimas proteolíticas são empregadas para o descolamento celular; no entanto, a exposição prolongada a essas enzimas pode alterar o fenótipo imunológico das células. Para mitigar esse problema, alguns estudos propuseram o uso de uma combinação de enzimas, reduzindo o tempo de exposição. Após a separação, as células podem ser extraídas dos microcarreadores usando um sistema de filtração com poros de tamanho apropriado, que retém os microcarreadores e permite a passagem das células. Além disso, há relatos de métodos alternativos, como microcarreadores termossensíveis, que facilitam a coleta de MSCs sem enzimas.
A interação entre os ligantes de superfície das MSCs e os microcarreadores aos quais estão ligados modula vias de sinalização essenciais. Materiais naturais que são componentes da matriz extracelular in vivo, como colágeno e gelatina, apresentam alta biocompatibilidade e promovem a adesão celular. Além disso, microcarreadores à base de gelatina e colágeno podem ser digeridos enzimaticamente, facilitando a coleta celular. No entanto, como muitos desses materiais são derivados de animais, seu uso na prática clínica não é recomendado. Alternativamente, polímeros sintéticos, tipicamente à base de poliestireno, servem como um material livre de xenogênicos definidor para a produção de microcarreadores. A biocompatibilidade e a capacidade de adesão celular desses polímeros sintéticos podem ser aprimoradas por meio de tratamentos físicos de superfície ou revestimentos com polímeros sintéticos que imitam ligantes naturais, promovendo assim a adesão e a proliferação celular.
Além disso, existem estudos utilizando biorreatores de fibra oca e biorreatores de leito fixo. Um desafio significativo associado aos biorreatores de fibra oca é a formação de gradientes longitudinais quando o meio de cultura ou o reagente de separação celular flui ao longo das fibras. Isso pode levar a uma distribuição inconsistente de nutrientes ou reagentes de separação. Da mesma forma, em sistemas de biorreatores de leito fixo em larga escala, gradientes de concentração axiais e radiais surgem devido à estrutura do leito, complicando a coleta de células devido à distribuição complexa dos reagentes de separação e à alta densidade de compactação das células. Em todos os sistemas dinâmicos, a tensão de cisalhamento é considerada uma das principais limitações na produção de um grande número de aglomerados celulares fenotipicamente estáveis com altas taxas de proliferação. O impacto da tensão de cisalhamento nas taxas de proliferação celular permanece um tópico de debate; no entanto, a maioria dos estudos sugere que a tensão de cisalhamento promove a diferenciação osteogênica e condrogênica. A força de cisalhamento influencia não apenas o crescimento de MSCs em biorreatores, mas também seus processos subsequentes. Tipicamente, os processos subsequentes para MSCs abrangem a separação, concentração, lavagem, preparação e criopreservação de células. Os princípios do desenvolvimento de processos subsequentes concentram-se na preservação da viabilidade e funcionalidade celular. As estratégias subsequentes devem estar em conformidade com os requisitos de Boas Práticas de Fabricação (BPF), ser escaláveis, automatizadas, fechadas e concluídas em um curto espaço de tempo. Além disso, dependendo da tecnologia de cultura escolhida, pode ser possível eliminar certas etapas do processo, o que pode proporcionar vantagens significativas. Por exemplo, o cultivo de células como agregados automontados pode não apenas replicar as condições in vivo, mas também eliminar a necessidade de separar as células dos microcarregadores.