Linfócito Infiltrante de Tumor
Os Linfócitos Infiltrantes de Tumor (TILs) são células mononucleares que ocorrem naturalmente e infiltram o microambiente tumoral de tumores sólidos, sendo frequentemente denominados células imunes presentes no local do tumor. A história dos TILs remonta há mais de dois séculos. Em 1863, Virchow observou que o tecido tumoral continha leucócitos. Em 1982, Steven Rosenberg, conhecido como o pai da Terapia Celular Adotiva (ACT), isolou TILs de um modelo tumoral em camundongos pela primeira vez. Ele relatou que a combinação de ciclofosfamida, TILs e interleucina (IL)-2 melhorou a condição de 50 a 100% dos camundongos com adenocarcinoma de cólon metastático para o fígado ou pulmões. Essa descoberta corroborou a eficácia da terapia com TILs no tratamento de câncer avançado. Em 1988, sua equipe realizou a primeira terapia com TILs em humanos, que resultou em uma regressão de 60% dos melanomas metastáticos.
As malignidades hematológicas possuem marcadores específicos de linhagem; no entanto, os tumores sólidos exibem heterogeneidade significativa e carecem de marcadores tumorais ideais. O direcionamento a Antígenos Associados a Tumores (TAAs) frequentemente leva à prevalência de células tumorais que não expressam marcadores específicos. Os TILs são células policlonais equipadas com múltiplos receptores capazes de reconhecer diversos TAAs, o que os torna mais eficazes do que células imunes geneticamente modificadas no tratamento de tumores sólidos. Os TILs podem abordar eficazmente a heterogeneidade tumoral e a evasão imune, resultando em melhores resultados clínicos em comparação com as Células T com Receptor de Antígeno Quimérico (CAR-T), particularmente em tumores sólidos com alta taxa de mutação, como o melanoma. Os TILs são predominantemente tumor-específicos e podem até mesmo atingir neoantígenos tumorais previamente não identificados dentro do microambiente tumoral, eliminando assim a necessidade de conhecimento prévio sobre TAAs ou restrição de MHC.
Os TILs são tipicamente categorizados em TILs Intratumorais (iTILs) e TILs Estromais (sTILs). iTILs são linfócitos raros localizados dentro de aglomerados de células tumorais, o que dificulta sua detecção, enquanto sTILs são mais comumente encontrados no estroma tumoral e são mais fáceis de identificar. A maioria dos TILs são células T de memória efetoras, que exibem proliferação robusta e funções antitumorais. Eles são ativados por antígenos associados a tumores (TAAs) in vivo e podem proliferar até 10⁵ vezes in vitro. Como células infiltrantes do microambiente tumoral, os TILs possuem receptores de quimiocinas que facilitam sua migração para o microambiente tumoral após a injeção. Além disso, os TILs têm uma vantagem significativa sobre as células CAR-T devido à sua menor toxicidade fora do alvo, que pode levar à seleção negativa do Receptor de Células T (TCR) durante a maturação das células T.
A terapia com TILs baseia-se em uma série de procedimentos específicos, incluindo linfodepleção não mieloablativa e a infusão de TILs, que são coletados de massas tumorais e expandidos ex vivo. Embora os TILs isolados de massas tumorais sólidas ressecadas possam reconhecer TAAs a partir de seus receptores endógenos, a quantidade limitada de TILs obtida representa um desafio significativo para a imunoterapia tumoral. O uso de Interleucina-2 (IL-2) como fator de crescimento de células T in vitro é um protocolo bem estabelecido para a expansão de TILs isolados. A exposição a altas doses de IL-2 induz a rápida proliferação de linfócitos, gerando um número suficiente de células imunes para a ACT. A terapia com TILs é considerada uma estratégia de tratamento eficaz para melanoma metastático refratário, particularmente quando combinada com linfodepleção não mieloablativa. A terapia com TILs depende da infiltração de células T policlonais que podem reconhecer múltiplos TAAs ou antígenos não identificados.
Em contraste, a maioria dos TILs responde a epítopos mutantes desconhecidos que não se tornam alvos de tolerância central durante a diferenciação das células T. Essa característica confere uma vantagem à terapia com TILs sobre outras formas de ACT. A toxicidade é frequentemente uma preocupação significativa após a administração de medicamentos terapêuticos. Estudos clínicos iniciais indicam que a terapia com TILs demonstrou um perfil de segurança favorável. No entanto, esse tipo de ACT está associado a efeitos colaterais consideráveis, principalmente quando combinado com altas doses de IL-2 e outras etapas de quimioterapia. A toxicidade pode se manifestar imediatamente em alguns pacientes ou levar algum tempo para se desenvolver; contudo, a implementação de práticas clínicas padrão pode ajudar a mitigar esses efeitos colaterais.
De modo geral, a principal vantagem da terapia com TILs é sua capacidade de proporcionar resultados clínicos estáveis e reprodutíveis para pacientes com progressão tumoral grave que foram excluídos de outras estratégias de ACT. No entanto, a terapia com TILs também enfrenta diversos desafios. Por exemplo, trata-se de um tratamento altamente personalizado, que exige a preparação de um produto de infusão específico para cada paciente. Consequentemente, a adesão às diretrizes de Boas Práticas de Fabricação (BPF) e o envolvimento de pessoal bem treinado são essenciais. Além do alto custo do processo de produção, o preparo do tratamento pode levar mais de um mês, o que pode ser inviável para pacientes com tumores de rápida progressão.
Em contraste com a terapia com TILs, a terapia com células T específicas para o tumor baseia-se no desenvolvimento de células T geneticamente modificadas que exibem atividade antitumoral aprimorada. Esse processo envolve a transferência de elementos genéticos que codificam Receptores de Células T (TCRs) modificados ou Receptores de Antígenos Quiméricos (CARs) sintéticos capazes de reconhecer antígenos tumorais específicos. Embora existam vários métodos para o desenvolvimento de células T geneticamente modificadas, a abordagem padrão geralmente envolve a coleta de células imunes específicas por meio de leucaférese, seguida de modificação genética e subsequente reinfusão. Semelhante à terapia com TILs, regimes de condicionamento são frequentemente empregados antes da terapia com células T modificadas por TCR.
Na terapia com células T modificadas por TCR, a especificidade das células T é determinada pelas cadeias α e β do TCR modificadas, permitindo o reconhecimento preciso de antígenos tumorais. A geração de células T transduzidas com genes de TCR específicos para TAAs oferece diversas vantagens em relação à terapia com TILs. Células T infiltrantes do microambiente tumoral nem sempre estão prontamente disponíveis e podem não se expandir em número suficiente para uma imunoterapia tumoral eficaz. Por outro lado, a transdução de TCRs modificados em linfócitos isolados do sangue periférico facilita a geração rápida de grandes quantidades de células T específicas para TAA. Além disso, a terapia com células T modificadas por TCR produz um número maior de células T ativadas específicas para neoantígenos e demonstra um potencial de proliferação superior em comparação à terapia com TILs, que pode apresentar um fenótipo de exaustão linfocitária devido à estimulação frequente. Embora a engenharia de TCR represente uma abordagem promissora para a imunoterapia tumoral, ela apresenta mais limitações do que a ACT baseada em TILs. Nesse sentido, o reconhecimento de apenas um antígeno tumoral específico pode permitir que as células tumorais escapem das células T modificadas por TCR, regulando negativamente as moléculas de MHC classe I ou os antígenos tumorais, levando à perda do antígeno. Além disso, as manifestações autoimunes resultantes do reconhecimento anormal do TCR representam uma preocupação significativa. As células normais expressam esses antígenos em baixos níveis; no entanto, TCRs de alta afinidade podem se ligar significativamente a esses epítopos restritos. Por fim, deve-se considerar o potencial para especificidade desconhecida do TCR, uma vez que as cadeias de TCR modificadas podem se parear incorretamente com as cadeias α e β do TCR endógeno, resultando em maior reatividade a autoantígenos.
As células CAR-T integram o reconhecimento baseado em anticorpos com a funcionalidade e a citotoxicidade das células T. A estrutura de TCR e os fragmentos de anticorpos específicos para moléculas-alvo expressas na superfície das células tumorais. Ao contrário da terapia TIL e das estratégias de modificação do TCR, o reconhecimento do CAR opera independentemente do processamento de peptídeos e da apresentação de antígenos em moléculas de MHC. Consequentemente, inúmeros antígenos de superfície celular podem ser considerados alvos potenciais para a ativação de CAR, o que representa uma vantagem significativa da terapia com células CAR-T em relação a outras formas de ACT. Em comparação com a terapia TIL, considerada um método mais seguro de ACT, as estratégias com células CAR-T apresentam diversos riscos de segurança. Estes incluem reatividade on-target e off-target, resultantes do reconhecimento do mesmo antígeno-alvo expresso em tecidos normais, bem como reações off-target devido à reatividade cruzada das células CAR-T com peptídeos não específicos. Além disso, a síndrome de liberação de citocinas e a síndrome de neurotoxicidade relacionada a células efetoras imunes são preocupações notáveis, caracterizadas pela secreção excessiva de citocinas inflamatórias por células imunes não específicas.
Processo de Preparação da Terapia com TILs
A quantidade e a funcionalidade dos TILs são dois fatores críticos que influenciam o sucesso da terapia com TILs. O método mais comum para a produção de TILs envolve o isolamento dessas células a partir de tecido tumoral ressecado e sua expansão ex vivo utilizando um Protocolo de Expansão Rápida (REP). O tumor é excisado cirurgicamente e fragmentado mecanicamente em pequenos pedaços. Posteriormente, esses fragmentos tumorais podem ser digeridos com a adição de enzimas como colagenase, DNase e hialuronidase. Os TILs são então separados por centrifugação em gradiente de densidade ou por técnicas específicas de triagem celular, incluindo triagem celular magnética ou por citometria de fluxo (MACS/FACS). Durante esse processo, as células T CD8+ podem ser enriquecidas, enquanto as células T reguladoras (Tregs) podem ser deplecionadas para aumentar a eficácia antitumoral da terapia com TILs. Embora a digestão mecânica e enzimática possa isolar rapidamente os TILs do tecido tumoral, esses métodos também podem comprometer a viabilidade das células T. Alguns estudos sugerem colocar fragmentos tumorais em um meio de cultura celular enriquecido com altas doses de IL-2 por duas semanas, permitindo que os TILs migrem gradualmente do tecido para o meio de cultura. No entanto, essa abordagem requer uma quantidade substancial de IL-2, que deve ser reposta a cada 2-3 dias.
Durante a fase de condicionamento, os TILs são inicialmente expandidos na presença de IL-2. Em algumas metodologias, após o condicionamento, os TILs específicos para o tumor são selecionados e expandidos posteriormente. Contudo, para reduzir o tempo de cultura in vitro e preservar a eficácia dos TILs, alguns estudos ignoram o processo de seleção dos TILs e expandem os estoques de TILs diretamente. Durante o condicionamento, altas doses de IL-2, anticorpos anti-CD3 e Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMCs) alogênicas irradiadas são introduzidas nas culturas de TILs como células alimentadoras. Embora a expansão de TILs seja alcançada principalmente por meio do tratamento com altas doses de IL-2, diversas outras técnicas de expansão e estimulação in vitro também podem ser empregadas, incluindo o uso de citocinas (como IL-15 e IL-21), moléculas coestimulatórias, inibidores de checkpoint imunológico e cocultura com Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) ou células alimentadoras.
Após o isolamento do tecido tumoral ressecado, vários métodos podem ser utilizados para detectar e eliminar células tumorais residuais durante a produção de TILs. Em protocolos de expansão rápida, as células tumorais residuais geralmente morrem durante o cultivo celular, uma vez que as condições de cultura são otimizadas para suportar apenas linfócitos. Além disso, os TILs obtidos por desagregação mecânica e centrifugação em gradiente de densidade podem ser filtrados utilizando uma malha específica para remover quaisquer células tumorais remanescentes. De acordo com o estudo, as células tumorais residuais também podem ser eliminadas utilizando monócitos estimulados com IL-2 ou cultivando-os em um ambiente livre de soro. Além disso, técnicas como a Triagem Celular por Ativação de Fluorescência (FACS) e a Triagem Celular por Ativação Magnética (MACS) podem ser utilizadas para remover células tumorais residuais dos produtos TIL. De modo geral, uma variedade de técnicas pode ser empregada para identificar células tumorais residuais, incluindo a Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qPCR) com oligonucleotídeos alelo-específicos, imuno-histoquímica, citometria de fluxo e Hibridização Fluorescente in Situ (FISH). Dentre essas, a avaliação de marcadores tumorais por citometria de fluxo é particularmente comum na produção de TILs.
O produto celular expandido é preparado para infusão de volta no paciente após passar com sucesso pelas medidas de controle de qualidade, que incluem testes de esterilidade, triagem para doenças transmitidas pelo sangue e análise fenotípica. Antes da infusão de TILs, o paciente passa por linfodepleção por meio de quimioterapia e radioterapia. O número necessário de TILs é então administrado por via intravenosa, acompanhado de múltiplas doses elevadas de IL-2. Embora a maioria dos ensaios clínicos administre a terapia com TILs por via intravenosa, vias alternativas de administração — como intrapleural, intraperitoneal, intratorácica ou intratumoral — também foram documentadas, dependendo da localização do tumor.
Os desafios da terapia com TILs decorrem do microambiente tumoral imunossupressor, da heterogeneidade tumoral e dos mecanismos que permitem ao sistema imunológico evadir a detecção. A ressecção de massas tumorais pode ser complicada devido à inacessibilidade de certos tecidos tumorais, e a cirurgia é considerada um procedimento invasivo para os pacientes. Além disso, após o isolamento dos TILs do tecido tumoral, sua expansão requer equipamentos especializados e conhecimento técnico. Apesar desses desafios, a expansão in vitro de TILs às vezes falha, e as altas doses de IL-2 utilizadas para a expansão podem estar associadas à toxicidade. Adicionalmente, o tempo de preparação dos TILs é de aproximadamente 6 a 8 semanas, o que pode afetar negativamente a eficácia terapêutica contra tumores de progressão rápida. Além disso, a baixa afinidade e persistência dos TILs isolados de tecidos tumorais, junto a deficiências em moléculas coestimulatórias, representam obstáculos adicionais ao sucesso da terapia com TILs.