Vírus Adeno-Associado (Virus Adeno Associated - “AAV”)
O vírus adeno-associado (VAA) é o vetor mais comumente utilizado em terapia gênica, com diâmetro de cerca de 20 nm e ausência de envelope. Seu genoma tem cerca de 4,8 kb de comprimento. O VAA não codifica a DNA polimerase e depende de células hospedeiras ou vírus auxiliares para sintetizar seu próprio genoma, portanto, não pode se replicar autonomamente. O VAA é bastante prevalente em humanos e outros primatas, com 11 sorotipos conhecidos. Além disso, muitas variantes artificiais do VAA foram desenvolvidas para melhorar a eficiência do VAA como vetores em aplicações clínicas e de pesquisa. Por exemplo, o Glybera®, o primeiro produto baseado em VAA aprovado no mundo, utiliza o AAV1 para administrar a lipoproteína lipase (LPL) para tratar pacientes com deficiência de LPL. O Luxturna® foi aprovado em 2017 como um tratamento baseado em VAA2 para amauquia congênita de Leber, que causa cegueira progressiva, e o Zolgensma® foi aprovado em 2019 como um tratamento baseado em VAA9 para atrofia muscular espinhal (AME).
Existem diferentes estratégias de plataforma para a produção upstream de AAV, incluindo infecção pelo vírus herpes simplex (HSV), sistema de vetor de expressão de células de inseto-baculovírus e linhagem celular de produção estável, mas o método baseado na transfecção transitória de células HEK293 por DNA plasmidial é atualmente o método principal para a produção de materiais clínicos, sendo mais flexível e fácil de usar, com baixo esforço inicial de engenharia, podendo, portanto, auxiliar no rápido início de estudos pioneiros em humanos. As etapas típicas do processo para a produção de AAV com base em transfecção transitória incluem: expansão celular baseada em cultura aderente ou em suspensão, transfecção plasmidial, produção de vetor viral, lise celular, purificação – incluindo clarificação, cromatografia de captura por afinidade, cromatografia de polimento por troca iônica, filtração em fluxo tangencial para concentração/diafiltração, filtração estéril final e preenchimento/acabamento.
A escolha entre cultura aderente e em suspensão deve ser considerada de forma abrangente com base nas capacidades técnicas da plataforma, nas etapas, nas indicações-alvo e nas vias de administração, e na demanda esperada por vetores virais. Para grandes populações de pacientes e aplicações que requerem administração sistêmica ou níveis mais elevados de vetores virais por dose, o desenvolvimento de uma estratégia de produção baseada em cultura em suspensão será mais propício para garantir a capacidade de escalonamento necessária, e foi relatado que a produção de cultura em suspensão de AAV de até 2.000 L foi alcançada. O objetivo do desenvolvimento do processo upstream é explorar as condições ideais para a produção do vírus, incluindo a melhoria da eficiência da transfecção e a garantia de sua consistência em condições de produção em larga escala, ajustando as condições de transfecção e intensificando a produtividade do vírus por meio de estratégias como a otimização das formulações do meio, mantendo a infectividade viral.
Embora alguns sorotipos de AAV secretem parcialmente partículas virais no meio de cultura celular durante o processo de cultivo, a fim de aumentar o rendimento do vírus, o processo downstream do AAV começa com a lise mecânica ou química das células e a fragmentação do DNA em condições fechadas. As etapas subsequentes de clarificação são projetadas para remover grandes quantidades residuais de DNA plasmidial, bem como contaminantes da célula hospedeira, da lise celular. A seleção do filtro deve considerar o nível de redução da turbidez, o alto rendimento do produto e a facilidade de escalonamento. Para a captura de AAV por cromatografia de afinidade, existem atualmente resinas de afinidade específicas para vários sorotipos. Normalmente, uma captura de afinidade em uma única etapa pode atingir alta pureza. No entanto, para garantir o nível específico de remoção de impurezas, a cromatografia de troca iônica é geralmente usada em combinação como uma etapa de polimento. Especialmente para o desafio de separar capsídeos vazios e cheios na produção de AAV, a cromatografia de troca iônica é atualmente o método mais comumente usado em escala de produção. Os capsídeos vazios são considerados impurezas em processo pelos reguladores e sua porcentagem precisa ser reduzida o máximo possível, e a proporção de capsídeos vazios/cheios controlada para garantir a consistência dos produtos de terapia gênica. A filtração de fluxo tangencial visa concentrar o produto e substituí-lo por um sistema tampão adequado. Tendo em vista o pequeno tamanho de partícula do AAV, módulos de membrana MWCO de 100 kD podem ser selecionados, enquanto a filtração estéril visa reduzir a carga microbiana e atender aos requisitos regulatórios de esterilidade exigidos.