Vacina de mRNA
O mRNA foi considerado um potencial Método de Vacinação Antitumoral muito antes da Vacina de mRNA contra o SARS-CoV-2 ter levado a tecnologia ao centro das atenções e, agora, dado o sucesso esmagador da Vacina contra a COVID-19, o mRNA tem sido explorado para uma variedade de outras aplicações, incluindo acinas contra outras doenças infecciosas, vacinas antitumorais e terapia de suplementação/reposição de proteínas, entre outras. Embora o mRNA seja sensível a ribonucleases onipresentes e possa ser rapidamente degradado, ele também apresenta fortes vantagens de segurança: não se replica, o que significa que não interage com o genoma, e sua relativa instabilidade e rápida depuração metabólica in vivo podem ser ajustadas por meio de vários métodos de modificação. A experiência bem-sucedida existente confirmou que, após a incorporação do mRNA em diferentes estruturas de administração, é possível obter rápida absorção e expressão proteica de alta eficiência após a administração.
O processo completo de produção de mRNA enfrenta múltiplos desafios, incluindo aqueles relacionados aos materiais de partida como o DNA plasmidial (Plasmidal DNA – “pDNA”) e aqueles relacionados às propriedades específicas do próprio mRNA, como sua alta sensibilidade à ribonuclease quase onipresente e ao estresse de cisalhamento durante o processamento, além dos desafios de separação e purificação devido ao tamanho semelhante do mRNA a certas impurezas, como o RNA fita dupla. Após a obtenção do molde de pDNA da sequência de interesse desejada, as etapas para a produção de mRNA a jusante, livre de células, podem ser resumidas como:
O mRNA é sintetizado em uma reação enzimática chamada Transcrição in Vitro (In Vitro Transcription – “IVT”), na qual um molde para a sequência de DNA alvo – pDNA linearizado, nucleotídeos e enzimas – são misturados.
O mRNA transcrito é então purificado da mistura de reação/contaminantes por meio de etapas como Cromatografia, Filtração em Fluxo Tangencial (Tangential Flow Filtration – “TFF”) e Filtração Estéril.
O mRNA é finalmente encapsulado em NanoPartículas Lipídicas (Lipidic NanoParticles – “LNPs”), tipicamente compostas por 4 componentes lipídicos, e o produto final é purificado e concentrado por TFF e/ou Cromatografia antes do envase asséptico.
Desafios da fabricação de mRNA
Síntese de mRNA
A síntese de mRNA sem células requer que o molde de pDNA seja linearizado com uma enzima de restrição que corta em um sítio específico do plasmídeo superenrolado. As impurezas associadas a essa etapa precisam ser removidas, por meio de TFF e/ou Cromatografia. Em seguida, o molde de DNA linearizado é Transcrito in Vitro (IVT) em mRNA. Adiciona-se RNA polimerase (como a RNA polimerase T7) e trifosfatos de nucleotídeos ao pDNA linearizado e purificado. Para aumentar a estabilidade do mRNA e reduzir a imunogenicidade, alguns trifosfatos de nucleotídeos modificados podem ser usados. Para estabilizar e permitir a transdução eficiente do mRNA nas células, são necessárias uma Cauda Poli-(A) 3′ e uma Capa 5′. A Cauda Poli-(A) é crucial para interromper a transcrição e a tradução de proteínas, impedindo que as Exonucleases 3′ digiram o mRNA. A Capa 5′ estabiliza o mRNA, impedindo a degradação pelas Exonucleases 5′. Dois métodos podem ser usados para capear o mRNA. A Capa pode ocorrer durante a etapa de transcrição ou após a IVT, e pode ser obtida enzimaticamente usando a Enzima de Capa do Vírus Vacínia, que geralmente capeia com mais eficiência, mas requer a purificação prévia do mRNA.
Purificação de mRNA
Após a IVT, o produto 3’Poli-(A)-mRNA-5′ Cap transcrito precisa ser purificado da mistura de endotoxina, RNA de Dupla Fita (“Double Stripe RNA – “dsRNA”) imunogênico, molde de DNA residual, RNA polimerase, fragmentos de RNA truncados, trifosfatos de nucleotídeos não utilizados e outras impurezas produzidas durante a reação de capeamento. Diversas opções estão disponíveis para a purificação de mRNA, tipicamente incluindo uma ou duas etapas Cromatográficas e etapas de Ultrafiltração/Diafiltração baseadas em TFF.
A Cromatografia de Afinidade é uma estratégia de purificação de alta eficiência comumente utilizada, como a Cromatografia Polideoxirribotimidina (Poly(dT)), que remove efetivamente DNA, nucleotídeos, enzimas, componentes do tampão, etc., sem Poli(A), capturando mRNA com Caudas Poli-A, mas não consegue distinguir dsRNA de RNA de Fita Simples (Single Stripe RNA – “ssRNA”). Após a Cromatografia de Afinidade inicial, geralmente há uma segunda etapa cromatográfica, chamada de Polimento, para purificar ainda mais o ssRNA, por exemplo, usando Cromatografia de Troca Aniônica. Às vezes, uma combinação de Cromatografia de Troca Iônica e Cromatografia de Interação Hidrofóbica é usada.
Uma maneira alternativa de separar o mRNA de impurezas menores é usar a TFF com um corte de peso molecular variando de 30 kDa a 300 kDa, o que também permite concentração e Diafiltração na mesma operação unitária.
No processo IVT padrão em modo batelada, o produto de RNA desejado é purificado da mistura de reação após a conclusão da reação, enquanto a polimerase, o molde de pDNA e os trifosfatos de nucleotídeos não reagidos são descartados. No entanto, devido ao alto custo desses componentes da reação IVT, alguns desenvolvedores tentaram usar uma estratégia de transcrição semelhante à de batelada alimentada para a produção de mRNA em larga escala. Durante o processo, o progresso da reação IVT foi monitorado para manter as condições ideais de reação e os componentes são adicionados ao reator conforme necessário. A eficiência na obtenção de produtos de RNA completos intactos, ou a probabilidade de transcritos truncados, depende do controle preciso da sequência de RNA e das condições de reação, e precisa ser otimizada para aumentar o rendimento do processo.
Encapsulamento de mRNA
O RNA é altamente sensível à rápida degradação por ribonucleases onipresentes, exigindo um sistema eficiente que não apenas estabilize o mRNA, mas também o introduza nas células. A incorporação de mRNA no sistema de entrega, acompanhado de combinações selecionadas de vários componentes lipídicos, demonstrou proteger o mRNA da degradação por ribonucleases, aumentar a captação celular e melhorar a tradução do mRNA em células-alvo.
Nanopartículas Lipídicas (Lipidic NanoParticles – “LNP”) são o sistema de entrega de mRNA mais comumente utilizado; elas são tipicamente compostas por 4 componentes lipídicos diferentes, incluindo lipídios catiônicos ionizáveis, fosfolipídios auxiliares, colesterol e PoliEtilenoGlicol (PEG)-lipídio. O encapsulamento do mRNA em um complexo lipídico o protege da degradação por ribonucleases, ao mesmo tempo em que o libera eficientemente no citoplasma das células.
O primeiro passo na preparação de LNP é dissolver os lipídios em um solvente (por exemplo, etanol) e, em seguida, misturar rapidamente os lipídios dissolvidos com um tampão aquoso de baixo pH contendo mRNA, utilizando um misturador de fluxo cruzado ou microfluídico para obter uma LNP que encapsula o mRNA. O controle ideal do canal de mistura e da velocidade é fundamental para obter o tamanho de partícula, a distribuição do tamanho de partícula e a eficiência de encapsulamento necessários. Os complexos mRNA-LNP resultantes foram diafiltrados para substituir o tampão de baixo pH por um tampão neutro. Esta etapa deve ser realizada rapidamente para evitar a degradação lipídica observada em pH baixo. A concentração é então realizada por Ultrafiltração.
As desvantagens das LNPs incluem a possibilidade de exigir logística de cadeia fria. Além disso, devido ao tamanho de partícula da LNP, nem sempre é possível realizar filtração estéril, sendo necessário considerar alternativas, como um Processo de Uso Único Totalmente Fechado.