Maximize o Desempenho do Seu HPLC: Cuidados Com o Sistema e Coluna

Autor Convidado: Dr. Richard McAllister, Phenomenex UK

A eficiência no laboratório depende não apenas da qualidade dos insumos e equipamentos, mas também da forma como eles são utilizados e cuidados no dia a dia. Em HPLC/UHPLC, manter os sistemas em bom estado e preservar a vida útil das colunas é uma parte crítica para garantir resultados reprodutíveis e evitar paradas inesperadas. Neste artigo, vamos explorar dicas práticas para manter seu sistema e suas colunas em excelente condição.

Antes de avançarmos, é importante destacar que as boas práticas de manutenção do sistema geralmente também beneficiam as colunas. A manutenção adequada do equipamento é essencial, mas nunca deve comprometer a integridade da coluna. Solventes e solutos percorrem o caminho do injetor ao detector de forma relativamente tranquila. No entanto, quando a coluna entra em cena, podem surgir complicações devido às diversas interações que ocorrem em seu interior. No modo de fase reversa (RP), por exemplo, impurezas altamente hidrofóbicas tendem a se acumular na coluna, especialmente sobre ou ao redor do frit de entrada, tornando-se um dos principais pontos de atenção.

Cuidados com o Sistema

Sistemas de HPLC/UHPLC são equipamentos sofisticados que, como qualquer instrumento complexo, estão sujeitos ao desgaste de componentes mecânicos e à falha de comunicação entre módulos eletrônicos. Por isso, contar com um contrato de manutenção preventiva é fundamental para garantir o bom funcionamento e a longevidade do sistema. Assim como um carro precisa de revisões regulares para operar de forma segura e eficiente, os sistemas de HPLC/UHPLC também exigem cuidados periódicos. Alguns contratos, inclusive, incluem a substituição de peças críticas, o que pode representar economia a longo prazo. Vale a pena consultar o fabricante ou empresas especializadas em manutenção para garantir o suporte adequado.

Além da manutenção formal, que pode ter um custo significativo, há práticas simples que ajudam a evitar problemas e reduzir a necessidade de assistência técnica. Um dos cuidados mais básicos, porém frequentemente negligenciado, é o uso de solventes grau HPLC, sempre desgaseificados. Embora seja tentador utilizar solventes de menor pureza para reduzir custos, isso pode comprometer seriamente o desempenho do sistema. Solventes como água (H₂O), acetonitrila (MeCN) e metanol (MeOH) de baixa qualidade podem conter impurezas e apresentar variações na composição, afetando o funcionamento das bombas e gerando resultados cromatográficos inconsistentes. Além disso, esses solventes podem causar danos em detectores, como UV-Vis, RI ou espectrômetros de massa (MS).

Outro ponto de atenção é o software. A comunicação entre o sistema e o computador pode falhar por simples falta de atualização. Embora contratos de manutenção geralmente incluam upgrades de software, é essencial garantir que tanto o sistema quanto o PC estejam atualizados, evitando falhas operacionais que podem interromper análises ou comprometer resultados.

A tubulação também merece atenção. Tubos de PEEK são amplamente utilizados por sua flexibilidade, resistência química e compatibilidade com aplicações biológicas. No entanto, o PEEK não é adequado para todos os solventes, compostos como tetrahidrofurano (THF), solventes clorados e ácidos concentrados podem degradá-lo. Antes de iniciar qualquer método, verifique se os solventes planejados são compatíveis com o material da tubulação. O uso inadequado pode danificar o sistema e exigir lavagens completas ou assistência técnica. Além disso, inspecionar regularmente os conectores entre bombas, colunas e detectores ajuda a prevenir vazamentos, evitar leituras incorretas de pressão e manter a sensibilidade da análise.

Em sistemas compartilhados por diferentes usuários ou métodos, a contaminação cruzada é um problema recorrente. Por exemplo, resíduos de amostras biológicas em um ensaio podem interferir em análises subsequentes de fármacos em matriz aquosa, gerando picos inesperados, ruído elevado ou aumento de pressão. Nesses casos, recomenda-se realizar uma lavagem completa do sistema antes e/ou depois de cada uso, especialmente quando há mudança de método ou matriz.

Cuidados com a Coluna

Na Phenomenex, ouvimos frequentemente relatos de analistas que enfrentam problemas com colunas de HPLC/UHPLC, e isso não é surpresa. Nessas técnicas, toda a separação química ocorre dentro da coluna. Os solventes e os analitos devem percorrer o sistema desde o injetor até o detector de forma eficiente, mas é dentro da coluna que acontecem as interações críticas de partição e separação. Felizmente, muitos dos problemas comuns podem ser evitados com alguns cuidados simples e boas práticas no uso e armazenamento das colunas.

Um dos primeiros passos importantes é testar a coluna nova logo após o recebimento. Sempre que possível, realize uma análise com padrões de referência antes de armazená-la. Isso garante que a coluna esteja em bom estado e permite detectar qualquer problema desde o início. A maioria das colunas é enviada com solventes de uso comum: colunas de fase reversa (RP), por exemplo, geralmente vêm acondicionadas em uma mistura de 65% acetonitrila (MeCN) e 35% água; já colunas de fase normal (NP) podem conter isopropanol ou hexano. Esses mesmos solventes devem ser utilizados para armazenamento, salvo instruções diferentes do fabricante. Jamais armazene colunas com solventes contendo tampões ou reagentes de emparelhamento iônico, pois isso pode comprometer permanentemente seu desempenho.

Uma dúvida frequente é: por quanto tempo posso armazenar uma coluna?

Embora não exista uma resposta única, o ideal é não ultrapassar seis meses sem uso. Após esse período, passe solvente fresco pela coluna e verifique sua performance antes de utilizá-la. Armazene sempre em local fresco, escuro (para evitar evaporação dos solventes) e na posição horizontal. Colunas armazenadas em pé correm o risco de secar e sofrer danos irreversíveis.

Assim como os sistemas, as colunas também exigem solventes de alta pureza, sempre grau HPLC, filtrados e desgaseificados. Ao iniciar o uso de uma nova coluna, programe a bomba para iniciar com um fluxo baixo (por exemplo, 0,1 mL/min) e aumente gradualmente até a vazão normal ao longo de cinco minutos. Para desligar o sistema, faça o caminho inverso, reduzindo lentamente o fluxo. Essa prática evita choques de pressão que podem afetar a estrutura interna da coluna e comprometer sua durabilidade.

Outro ponto essencial é respeitar a pressão máxima recomendada. As colunas da Phenomenex com partículas totalmente porosas de 10 µm, 5 µm e 3 µm, bem como as colunas com tecnologia TWIN, suportam até 250 bar*. Já as colunas UHPLC da marca são compatíveis com pressões de até 1000 bar*. Embora as colunas tolerem breves picos acima do limite, operar com pressões excessivas de forma contínua reduz significativamente sua vida útil. A atenção à pressão se torna ainda mais importante com o tempo, pois aumentos graduais costumam indicar acúmulo de resíduos ou obstruções.

* Entre em contato ou consulte o manual da coluna para confirmar os limites de pressão da unidade adquirida.

Uma das causas mais comuns da degradação precoce de colunas é a injeção de amostras mal preparadas. Entendemos que o preparo de amostras pode ser trabalhoso e oneroso, mas negligenciar essa etapa muitas vezes resulta em colunas com vida útil extremamente curta, às vezes durando apenas 100 injeções. Amostras contaminadas podem danificar a coluna tanto física quanto quimicamente.

Fisicamente, os particulados se acumulam no frit de entrada, provocando obstruções e aumento da pressão. Quimicamente, contaminantes como fosfolipídios, muito comuns em matrizes biológicas, se aderem à fase estacionária (como C18), reduzindo seletividade, retenção e sensibilidade. Isso pode inutilizar a coluna, exigindo sua substituição.
A boa notícia é que existem soluções eficazes e acessíveis. No caso dos fosfolipídios, por exemplo, o Phree™ é uma ferramenta prática para removê-los, eliminando mais de 99% dessas substâncias. Produtos como esse exigem pouco tempo adicional, mas oferecem ganhos significativos em desempenho e economia a longo prazo. Em casos onde a coluna já esteja comprometida, procedimentos de limpeza podem ajudar, mas sempre siga as instruções do fabricante.

Em certas situações, técnicas como SPE (extração em fase sólida) podem não ser viáveis, seja por custo, tempo, ou porque os interferentes têm propriedades semelhantes aos analitos e não podem ser removidos sem perdas. Nesses casos, o uso de uma Pré-Coluna pode ser uma excelente alternativa.

O sistema SecurityGuard™, da Phenomenex, oferece uma solução simples e eficiente. Ele consiste em um suporte reutilizável (holder) e um cartucho descartável. Instalado antes da coluna analítica, o SecurityGuard atua como uma barreira contra contaminantes e particulados, prolongando a vida útil da coluna principal e protegendo o investimento feito no sistema cromatográfico.

A substituição periódica do cartucho é rápida, econômica e pode melhorar significativamente a reprodutibilidade dos resultados.

Figura 1 – Corte do suporte SecurityGuard com o cartucho inserido, conectado à frente de uma coluna HPLC, bloqueando contaminantes.

Longevidade da Coluna

Pré-colunas não são obrigatórias para todos os métodos, mas em análises com matrizes complexas ou com amostras pouco purificadas, elas fazem uma grande diferença. Se você está enfrentando baixa durabilidade das colunas, o melhor conselho é: invista no preparo de amostras e na utilização de pré-colunas, especialmente em UHPLC, onde o diâmetro reduzido das partículas torna o sistema mais sensível a obstruções.

Para mais informações sobre cuidados com colunas, sistemas e preparo de amostras, incluindo as linhas SecurityGuard™, Phree™ e SPE, acesse https://www.allcrom.com.br/categoria-produto/consumiveis/

Boas análises, e vida longa às suas colunas!